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FLIM系統(tǒng)是如何進(jìn)行工作的?

更新時(shí)間:2024-04-16 點(diǎn)擊次數(shù):1256

FLIM系統(tǒng)是如何進(jìn)行工作的?


熒光壽命顯微成像(fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM)是一種用于研究和測量生物分子的熒光壽命的技術(shù),因其可以用于無標(biāo)記成像,具有快速響應(yīng)時(shí)間,可通過高分辨率成像技術(shù)(如共聚焦顯微鏡或雙光子顯微鏡)結(jié)合使用等特點(diǎn),近年來已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究和生命科學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域。那么,F(xiàn)LIM是如何實(shí)現(xiàn)如此強(qiáng)大的功能呢?


FLIM的首要任務(wù)就在于測量熒光壽命(Fluorescence lifetime, FL),待測物體被一束激光激發(fā)后,該物體吸收能量后,從基態(tài)躍遷到某一激發(fā)態(tài)上,再以輻射躍遷的形式發(fā)出熒光并回到基態(tài)。將激發(fā)光關(guān)閉后,分子的熒光強(qiáng)度也將隨時(shí)間逐漸下降。


假定一個無限窄的脈沖光(δ函數(shù))激發(fā)n0個熒光分子到其激發(fā)態(tài),處于激發(fā)態(tài)的分子將通過輻射或非輻射躍遷返回基態(tài)。假定兩種衰減躍遷速率分別為Γ和Knr,則激發(fā)態(tài)衰減速率可表示為:

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其中n(t)表示時(shí)間t時(shí)激發(fā)態(tài)分子的數(shù)目,由此可得到激發(fā)態(tài)物種的單指數(shù)衰減方程:


n (t) = n0 exp (-t / τ)


上式中衰減總速率的倒數(shù)τ=(Γ+Knr)-1即為熒光壽命。熒光強(qiáng)度正比于衰減的激發(fā)態(tài)分子數(shù),因此可將上式改寫為:


I (t) = I0exp (-t / τ)


該式中,I0即為分子受激發(fā)時(shí)的最大光強(qiáng)。我們將該熒光強(qiáng)度下降至激發(fā)時(shí)的熒光最大強(qiáng)度I0的1/e(約37%)所需要的時(shí)間,稱為熒光壽命。


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圖1 熒光壽命曲線示意圖


對于測量熒光壽命的方式可大致分為以下兩種,頻域法與時(shí)域法。而時(shí)域法還可進(jìn)一步分為門控法、條紋相機(jī)法與TCSPC法(Time-Correlated Single Photon Counting, 時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù))。目前,應(yīng)用最為廣泛的是TCSPC法,其基本原理是在一個極短的時(shí)間窗口內(nèi)精確測量單個光子的到達(dá)時(shí)間。當(dāng)激光或其他光源激發(fā)樣品時(shí),樣品會發(fā)射熒光光子。這些光子傳播到檢測器,其中每個光子的到達(dá)時(shí)間都被記錄下來。記錄到達(dá)時(shí)間的數(shù)據(jù)可以被用來創(chuàng)建熒光壽命的時(shí)間衰減曲線,該曲線描述了熒光光子的時(shí)間分布。通過分析這些時(shí)間分布,可以獲得關(guān)于樣品的信息,如熒光壽命、發(fā)光光譜和熒光量子產(chǎn)率。其基本原理是測量光子到達(dá)探測器的時(shí)間。當(dāng)一個光子被探測到時(shí),會觸發(fā)一個計(jì)數(shù)器,記錄光子到達(dá)的時(shí)間。通過多次測量并記錄光子到達(dá)的時(shí)間,可以生成光子到達(dá)時(shí)間的分布曲線,如圖2所示,從而獲得有關(guān)樣品的信息。


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圖2 TCSPC原理示意圖


TCSPC系統(tǒng)具有非常高的時(shí)間分辨率,通常在皮秒(ps)級別。這使得它能夠精確測量光子到達(dá)時(shí)間,即使在非常短的時(shí)間尺內(nèi)也能實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確的測量,且可以處理極低光子計(jì)數(shù)的數(shù)據(jù)?;诮y(tǒng)計(jì)分析的TCSPC法避免了熒光強(qiáng)度的直接測量,因而信噪比較高,探測效率近乎理想。但由于通常需要多次重復(fù)掃描來為每個像素采集足夠多的光子用于擬合熒光壽命,成像時(shí)間通常會較長。因此,如何提高成像速度與測量精度成為了人們關(guān)注的重點(diǎn)。近些年來,隨著超快激光技術(shù)、高速高靈敏探測技術(shù)以及圖像處理技術(shù)等相關(guān)技術(shù)發(fā)展,為開發(fā)廉價(jià)、高性能、多功能的熒光壽命成像系統(tǒng)創(chuàng)造了條件。


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圖3 FLIM系統(tǒng)示意圖


上海昊量光電新推出了意大利FLIM LABS公司的熒光壽命成像FLIM入門套件系統(tǒng),專門為追求單光子FLIM成像和熒光壽命光譜應(yīng)用而設(shè)計(jì),能為您帶來高性能、高性價(jià)比的FLIM解決方案。該套件包括熒光壽命成像FLIM數(shù)據(jù)采集卡TDC、光纖耦合皮秒脈沖激光器模塊、SPAD單光子探測器與熒光壽命成像FLIM軟件,并在您需要時(shí)提供恒比鑒相器模塊。


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圖4 FLIM LABS的熒光壽命成像FLIM入門套件


FLIM數(shù)據(jù)采集卡TDC:


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我們的緊湊型 USB 供電數(shù)據(jù)采集卡專為熒光壽命成像和光譜測量而設(shè)計(jì)。其基于FPGA的可定制技術(shù),尺寸101x139x28mm,重量輕(僅120克),總計(jì)26個I/O通道可分辨熒光壽命50ps,死區(qū)時(shí)間1.5 ns,計(jì)時(shí)精度(σ/√2)300ps,24 或 48 ps 時(shí)間 bin 分辨率,并能通過USB3.0與PC軟件直接連接,無需額外供電。


光纖耦合皮秒脈沖激光器模塊:


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我們的激光器模塊可用波長有405、445、488、520、635 和 850 nm,譜寬±10nm,獨(dú)立模塊,無需連接電腦。脈沖持續(xù)時(shí)間低至 50ps (FWHM) ,單模光纖耦合(FC/PC),150mW脈沖峰值,功率80MHz 時(shí)平均 CW 功率為 1.5mW,提供外部和內(nèi)部數(shù)字同步觸發(fā)。


SPAD單光子探測器:


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我們的 USB 供電光纖耦合單光子 SPAD 探測器專為時(shí)間分辨熒光壽命成像和光譜測量而設(shè)計(jì)。尺寸?。?00x60x30mm)且重量輕(235g),可通過 USB 供電,光譜響應(yīng)范圍從 370nm 到 900nm,7 cps 暗計(jì)數(shù),抖動小于200ps。 


熒光壽命成像FLIM軟件:

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我們的FLIM Studio軟件旨在簡化熒光壽命光譜和成像實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)采集、重建和分析。該環(huán)境提供了用戶友好的界面和任何用戶都可以使用的直觀工具??梢宰龅綄?shí)時(shí)成像和熒光衰減直方圖數(shù)據(jù)重建,實(shí)時(shí) FLIM 相量圖分析,并人工智能驅(qū)動的相量圖分析技術(shù),提供用于數(shù)據(jù)采集和重建的軟件 API(Rust、C、C++、C#、Python、node.js、.N ET),支持MATLAB、Python、HDF5、.SVG FLIM 相量和成像數(shù)據(jù)導(dǎo)出。


恒比鑒相器CFD:

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我們的恒定分?jǐn)?shù)鑒別器(CFD)結(jié)構(gòu)緊湊,性能好。恒比鑒相器CFD允許用戶將模擬信號(例如,來自PMT的信號、脈沖激光源的同步信號等)轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號。恒比鑒相器CFD模塊非常易于使用,可以與不同的顯微鏡或光譜設(shè)置相結(jié)合。單通道雙輸出模塊,區(qū)分正負(fù)輸入信號,支持上升時(shí)間<500ps,抖動<15ps,最大重復(fù)頻率為140MHz,最小輸入可檢測信號為+/- 100mV,最大輸出信號:4V@50Ohm 。


歡迎隨時(shí)與我們聯(lián)系溝通FLIM系統(tǒng)的使用,我們會根據(jù)您的需求幫您進(jìn)行權(quán)衡!


更多詳情請聯(lián)系昊量光電/歡迎直接聯(lián)系昊量光電

關(guān)于昊量光電:

上海昊量光電設(shè)備有限公司是光電產(chǎn)品專業(yè)代理商,產(chǎn)品包括各類激光器、光電調(diào)制器、光學(xué)測量設(shè)備、光學(xué)元件等,涉及應(yīng)用涵蓋了材料加工、光通訊、生物醫(yī)療、科學(xué)研究、國防、量子光學(xué)、生物顯微、物聯(lián)傳感、激光制造等;可為客戶提供完整的設(shè)備安裝,培訓(xùn),硬件開發(fā),軟件開發(fā),系統(tǒng)集成等服務(wù)。

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